HCMV IE86介导的乙酰化调控参与神经胶质瘤发展的作用机制研究

【摘要】人巨细胞病毒(HCMV)感染和恶性神经胶质瘤关系密切,病毒编码的最主要即刻早期调控蛋白IE86与p300/CBP形成复合体,激活宿主细胞多种转录因子,在感染过程起重要作用。有研究发现IE86可与细胞内转录因子CREB相互作用,同时我们前期研究发现CREB/ATF家族新成员转录激活因子5(ATF5)也可与p300/CBP相互结合。ATF5是一个与肿瘤、特别是胶质瘤密切相关的转录因子,在胶质瘤等多种肿瘤中特异性高表达,可通过调控下游基因Egr-1,Bcl-2及Mcl-1等促进肿瘤细胞增殖,抑制凋亡。本项目首先在临床病理标本中确证HCMV感染与胶质瘤病理分级及ATF5表达之间的关系；再通过CoIP、激光共聚焦等技术研究IE86与ATF5在细胞内相互作用模式和共定位；在此基础上建立IE86过表达胶质瘤细胞荷瘤鼠模型,研究IE86蛋白对胶质瘤细胞生物学行为和ATF5乙酰化水平的影响。项目以表观遗传调控乙酰化作用为切入点,研究HCMV在中枢神经系统漫长的感染过程中,IE86是如何调控细胞转录因子的表达水平变化,进而参与神经细胞恶性行为的进程。研究从一个新的角度来探讨HCMV感染在神经胶质瘤发展过程中所扮演的角色。目的：1.检测不同临床分级的神经胶质瘤临床标本中HCMV感染率、IE86表达与ATF5表达的相关关系。分析HCMVIE86在不同分级的神经胶质瘤中表达的差异,以其确证HCMV感染与神经胶质瘤发生、发展的相关性。2.建立体外培养的胶质瘤细胞模型,研究HCMVIE86与ATF5的相互作用,以及该作用对宿主细胞转录因子蛋白乙酰化水平和生物学行为的影响及其分子机制。3.建立IE86过表达胶质瘤细胞裸鼠荷瘤模型,研究IE86蛋白对肿瘤生物学行为的影响及可能的分子机制。方法：1.通过免疫组织化学技术,检测不同临床病例分级的神经胶质瘤临床标本中HCMVIE86和ATF5的表达,统计分析HCMV感染及ATF5表达与神经胶质瘤发生及进展的相关性。2.扩增HCMV病毒,测定病毒滴度。体外培养胶质瘤细胞系U87,设立无血清培养组,病毒感染及IE86转染组,qRT-PCR、western-blot检测IE、ATF5等基因的表达变化；MTT检测细胞增殖；流式细胞术检测凋亡率改变。观察病毒感染及IE86转染在培养基血清撤离环境下,对胶质瘤细胞的影响。同时设立ATF5RNAi表达抑制组,研究ATF5参与病毒感染及IE过表达引起肿瘤增殖凋亡改变中的分子机制。3.利用激光共聚焦技术观察体外培养的U87胶质瘤细胞中IE86与ATF5的亚细胞水平共定位；利用免疫共沉淀技术研究IE86蛋白与ATF5的相互作用,同时利用Westernblot、免疫共沉淀技术分析IE86过表达对ATF5表达及乙酰化水平的影响。探讨HCMVIE86蛋白调控肿瘤细胞生长的分子机制。4.将IE86过表达的胶质瘤细胞U87注射入裸鼠腋下,同时设立ATF5表达缺失组及对照组。观察注射部位直至成瘤,记录裸鼠出瘤的时间、肿瘤的大小,观察移植瘤的组织结构特点,计算活体移植瘤的体积。终止实验时,取一部分移植瘤Western-blot技术检测ATF5表达变化及乙酰化水平。结果：1.53例脑星形胶质细胞瘤和5例非肿瘤组织免疫组织化学染色结果提示,1HCMVIE和ATF5在间变性胶质瘤(anaplasticgliomas,AG)、胶质母细胞瘤(glioblastomamultiforme,GM)和低级星形细胞瘤(low-gradegliomas,LGG)中的表达水平明显高于非肿瘤组织,差异有统计学意义；HCMVIE阳性率与ATF5表达成明显正相关关系(r=0.810,P<0.01)。2.ATF5在胶质瘤细胞系U87中高表达,培养液血清缺失,会抑制U87细胞的增殖,引起镜下可见的细胞皱缩凋亡。CCK-8检测结果显示,HCMV感染和IE86过表达可促进细胞的增殖；流式细胞术凋亡检测显示,IE86过表达可帮助细胞抵抗血清缺失引起的细胞凋亡。而对于ATF5表达抑制组,HCMV感染及IE86过表达则不会使U87细胞抵抗血清缺失引起的细胞凋亡。3.qRT-PCR及Westernblot检测结果显示,培养液血清缺失会下调ATF5的表达,而HCMV感染及IE86过表达,会促进ATF5及其下游基因的表达。4.免疫荧光结果显示,IE86蛋白和ATF5在U87胶质瘤细胞内共定位于细胞核；免疫共沉淀结果显示IE86与内源性ATF5存在相互作用；通过ATF5蛋白氨基端缺失负显性抑制载体研究发现,IE86与ATF5的结合依赖于其氨基端脯氨酸富集的区域。5.免疫共沉淀及westernblot结果显示,血清饥饿48h后,ATF5的乙酰化水平下降,与乙酰化酶p300的结合减弱；IE86过表达会加强ATF5与p300的结合,提高ATF5的乙酰化水平,从而促进细胞增殖。6.体内实验结果显示,成功构建出胶质瘤裸鼠皮下移植瘤动物模型。正常U87细胞中,HCMVIE86过表达组裸鼠的肿瘤体积增长速度、肿瘤终体积及重量均明显高于其他对照组(p<0.05)。westernblot方法检测情况显示,IE86过表达组的ATF5表达水平及乙酰化水平均明显高于对照组(P<0.05)。在ATF5表达抑制U87中,HCMVIE86过表达不会加速肿瘤生长,增加肿瘤的终体积。结论：1.HCMVIE86及ATF5在胶质瘤中高表达,表达具有相关性,且与胶质瘤病理分级程度正相关。2.HCMV感染及IE86过表达能在体外增强胶质瘤细胞系U87的增殖活力,降低由于血清饥饿对细胞凋亡的影响；IE86过表达在体内可提高胶质瘤的成瘤速度及瘤体大小。3.IE86与ATF5的表达共定位于细胞核,且IE86在细胞内能与ATF5相互作用,提高ATF5的乙酰化水平,进而发挥促胶质瘤细胞增殖作用。
【作者】胡明；
【导师】王斌；
【作者基本信息】青岛大学，病原生物学，2014，博士
【关键词】ATF5；HCMV感染；乙酰化；凋亡；胶质瘤；

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